作者：林桂枝，邱建武，邓梅，林伟霞，郭丽，宋元宗。
医院
摘自《中国当代儿科杂志》年第3期
病史
患儿，男，4月龄，因发现皮肤、巩膜*染近4个月就诊。
患儿生后第4天即出现皮肤、巩膜*染，到3月龄时仍未消退，医院住院诊治。期间查血生化指标发现丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBil）、直接胆红素（DBil）和间接胆红素（IBil）水平均升高，巨细胞病*IgM水平升高（表1）。纸片血串联质谱筛查未见明显异常，而尿GC-MS显示4-羟基苯乳酸和4-羟基苯丙酮酸水平升高。诊断为胆汁淤积症和巨细胞病*感染。予抗病*和对症支持治疗后，患儿*疸无明显改善，于3.4月龄时出院。因*疸加重，患儿于3.6月龄时再次住院，期间复查肝功能指标仍明显异常（表1），且腹部超声检查发现肝脏弥漫性增大。
继续予祛*利胆等治疗，*疸仍未明显改善。患儿3.8月龄时，因疑诊希特林缺陷病而停母乳喂养，改用无乳糖并强化中链甘油三酯的配方奶粉喂养，病情无好转。
4月龄时为明确病因遂至我院就诊。自起病以来，患儿精神食欲可，大小便基本正常。
患儿系第2胎第2产，孕39+5周时，因疤痕子宫剖宫产，出生体重为g，身长51cm。
父母非近亲结婚，否认遗传病家族史。
入院查体
神志清楚，反应可。皮肤、巩膜轻微*染，浅表淋巴结不大。头颅及五官无畸形。双侧瞳孔等大等圆，直径3mm，对光反射灵敏。双肺呼吸音清，未闻及干湿啰音。心音有力，律齐，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。腹软，肝脏右肋下3.5cm，质地中等，脾不大，肠鸣音正常。腹壁、膝腱和跟腱等生理反射存在，克氏、布氏和巴氏征均阴性。
辅助检查
生化检查发现肝功能明显异常（表1），
甲胎蛋白ng/mL
（参考值0~10ng/mL），
25-羟维生素D5.79nmol/L
（参考值30~nmol/L）。
线粒体DNA高敏感性测序分析未发现线粒体DNA变异。
基因检测
本研究经医院医学伦理委员会批准（批件号：KY--），并请父母签署知情同意书。
用EDTA抗凝管收集患儿静脉血2mL，并用MiniKit试剂盒（杭州新景生物试剂开发有限公司）提取基因组DNA。基因组DNA经打断、末端修复、扩增、纯化后，建立含有与代谢性肝病（包括胆汁淤积症）相关基因（ACADVL、B4GALT1、C10orf2、DBT、EARS2、FADD、SLC25A13、VIPAS39及VPS33B等共个基因）的基因组文库。用液相捕获试剂盒（迈基诺公司，中国）捕获上述目标基因，新一代测序仪HiSeq（Illumina公司，美国）对其进行高通量测序。得出数据后进行基因序列的生物信息学分析，找出致病基因并判断其突变性质。
根据二代测序结果，提取患儿及其父母的外周血DNA进行Sanger测序，验证DGUOK基因突变。所用聚合酶链反应引物由PrimerPremier5.0软件根据DGUOK基因的DNA序列设计（表2）并由北京迈基诺基因科技股份有限公司合成。PCR具体反应体系、温度条件及流程参照文献。
通过EnsemblGenomeBrowser中的人DGUOK基因的直系同源列表收集个同源肽的氨基酸序列，然后使用BLAST/BLATEnsembl软件进行比对。采用MutationTaster、PROVEAN、PolyPhen2、SIFT等在线软件工具，并结合ACMG标准预测突变致病性。
代谢性肝病组套二代测序检查发现患儿DGUOK基因存在c.CT(p.GlnTer)和c.GC(p.TrpCys)两个突变，而Sanger测序验证了该结果，并发现以上突变分别来自于父母（图1）。
突变c.CT(p.GlnTer)为无义突变，为极强的致病性证据（PVS1）。该无义突变与错义突变c.GC(p.TrpCys)均未被千人基因组数据库、人类基因突变数据库、外显子组测序项目、ExAC数据库及PubMed数据库收录，满足中等强度的致病证据（PM2）。两个突变分别来自父母，也是中等强度致病证据（PM3）。此外，多种生物信息学软件分析均提示突变c.GC(p.TrpCys)具有致病性且影响蛋白功能，为支持性致病证据（PP3）。患儿*疸、肝脏肿大及肝功能异常等主要临床表现和实验室改变符合DGUOK相关MDS特征，为支持性致病证据（PP4）。根据ACMG标准和指南，无义突变c.CT(p.GlnTer)评级描述为PVS1+PM2+PM3+PP4，可判定为致病性突变；而错义突变c.GC(p.TrpCys)评级描述为PM2+PM3+PP3+PP4，属于可能致病性突变。
治疗与随访
患儿4月龄时首次至我院门诊就诊，诊断为“胆汁淤积症”，予门诊对症支持治疗并定期随访复查，但ALT、AST、TBA、TBil等肝功能生化指标持续异常（表1）。7月龄时因“皮肤、巩膜*染加重合并发热”再次至我院门诊就诊，体格检查发现腹部膨隆，肝脏右肋下6cm，质地偏硬，诊断为胆汁淤积症和急性上呼吸道感染，予头孢克肟、骨化三醇等治疗。后失访，结局不明。
最终诊断
结合基因诊断结果，最终诊断为DGUOK相关的线粒体DNA耗竭综合征（MDS）
文献回顾
首先以“线粒体DNA耗竭综合征”和“DGUOK”为关键词在CNKI数据库、万方数据库、维普数据库（建库至年4月）中检索，然后以“DGUOK”为检索词查阅PubMed数据库和人类基因突变数据库（建库至年4月）。收集资料信息完整患儿的临床和遗传学资料进行系统分析总结，包括基因突变类型、临床表现、实验室检查、影像学检查等。
以“线粒体DNA耗竭综合征”和“DGUOK”为关键词，在CNKI数据库、万方数据库、维普数据库中仅检索到1例国内患者；以“DGUOK”为检索词查阅PubMed数据库、人类基因突变数据库，发现国外文献共报道本病患儿例，涉及文献33篇。例患儿中，男女比例为52:57（4例性别未注明）；新生儿期发病56例（49.6%），6个月之内发病96例（85.0%）；主要临床表现为*疸67例（59.3%），肝功能衰竭66例（58.4%），胆汁淤积56例（49.6%），肝脏肿大41例（36.3%），生长发育落后41例（36.3%），肌张力低下37例（32.7%），眼球震颤24例（21.2%），精神运动迟缓14例（12.4%），喂养困难13例（11.5%）。例患儿中，只有77例交代了地区，其中亚洲37例（48%），欧洲31例（40%），北美洲4例（5%），非洲5例（6%）。
实验室检验及检查方面（按实际检测病例进行统计）：血液DBil、ALT、AST、乳酸和酪氨酸升高分别见于%（31/31）、96%（43/45）、95%（39/41）、94%（80/85）和80%（28/35）的患儿；64.6%（73/）的患儿发生过低血糖；甲胎蛋白（88%，46/52）和血清铁蛋白（91%，10/11）水平升高在患儿中也相当常见。78%（25/32）的患儿头颅MRI检查无明显异常，但MRS检查可见高乳酸峰（69%，9/13）。
预后方面：例患儿中，有90例（79.6%）死亡，死亡年龄在14d至30个月，提示本病预后不良。
遗传学分析方面（按实际检测病例进行统计）：肝线粒体呼吸链酶活性测定结果显示，复合物Ⅰ（96%，43/45）、Ⅲ（93%，38/41）、Ⅳ（99%，46/47）、Ⅴ（93%，13/14）活性多有不同程度降低，而复合物Ⅱ活性大多正常（88%，37/42）。肝线粒体DNA定量测定结果显示，41例（95%，41/43）DNA拷贝数显著降低，为参考值的2%~39%。例患儿共检出61种DGUOK基因突变类型，其中错义突变最常见（52%，32/61），其次为缺失突变（20%，12/61）、无义突变（11%，7/61）、剪接位点突变（8%，5/61）、插入突变（5%，3/61）和重复突变（3%，2/61）。
讨论
DGUOK基因定位于染色体2p13，由7个外显子组成，编码含个氨基酸残基的脱氧鸟苷激酶（dGK）。该酶磷酸化线粒体基质中嘌呤脱氧核糖核苷，介导线粒体嘌呤核苷补救合成途径的第一步。线粒体DNA的合成需要脱氧核糖核酸三磷酸盐（dNTPs）的平衡供应，而线粒体dNTP池需要通过线粒体核苷补救合成途径持续供应dNTPs来维持。因此，DGUOK基因的致病突变导致线粒体dNTP池失衡，最终引起mtDNA耗竭。dGK是一个同源二聚体蛋白，每一个单体包含5个β片层和9个α-螺旋结构。其中第9个α-螺旋C末端可与底物磷酸盐供体结合，对酶活性起着重要作用。
无义突变c.CT(p.GlnTer)在核苷酸~处产生一个提前终止密码子，产生只含个氨基酸残基的截短蛋白。该蛋白不含第9个α-螺旋结构域，因此将基本丧失dGK活性。错义突变c.GC(p.TrpCys)未被千人基因组数据库、人类基因突变数据库、外显子组测序项目、ExAC数据库及PubMed数据库收录，与另一致病性突变分别来自父母，此外多种生物信息学软件分析提示该突变可能具有致病性且影响蛋白功能。上述两个DGUOK基因新突变将共同影响dGK的功能，导致dNTP池失衡，最终造成本文患儿线粒体DNA耗竭而出现一系列临床表现。
本文MDS患儿以*疸、肝脏肿大及肝功能异常为主要临床特征，多次生化检查均显示ALT、AST、GGT、TBA、TBil、DBil和IBil这些指标升高。患儿DGUOK基因致病突变导致线粒体DNA耗竭，引起呼吸链功能障碍，从而导致受影响的器官能量产生不足，最终影响器官功能。肝脏和脑代谢旺盛，能量需求量也大，这就解释了文献回顾本病患儿以这两个系统受累表现为主的现象；而当DGUOK功能减弱较轻时可能导致孤立性肝病。本文患儿虽然DGUOK基因检出无义突变c.CT(p.GlnTer)，但另一个突变c.GC(p.TrpCys)可能只是部分影响dGK活性，这可能是本研究MDS患儿以孤立性肝病表现为主要临床特征的原因。但随着病情的进展，是否最终会出现神经系统等其他系统受累表现，有待进一步研究。
除了肝功能异常，本文患儿还存在血乳酸增高，这可能与线粒体呼吸链功能障碍、能量产生不足、葡萄糖有氧酵解受抑制而无氧酵解增强有关。患儿尿液中4-羟基苯乳酸和4-羟基苯丙酮酸排泄增多，并非其特异性标志，也可见于肝功能障碍患者。值得一提的是，本文患儿甲胎蛋白水平高达ng/mL。有研究表明许多DGUOK相关MDS患者血清甲胎蛋白水平升高，高达ng/mL以上。有研究表明血乳酸和甲胎蛋白的轻度升高可加强对DGUOK相关MDS的怀疑。
目前MDS治疗以对症支持为主，营养调节和辅助因子补充可能有益。由于多器官受累，MDS患者的肝移植存在争议。据报道，一些患有孤立性肝病的患儿通过肝移植可存活达10年，而孤立性肝病患者在肝移植后可出现神经功能障碍。
本研究在报道1例DGUOK相关MDS患儿临床表现和实验室特点基础上，对本病基因型和临床表型特征进行了系统文献回顾。研究结果扩展了DGUOK基因突变谱，为患儿确诊和遗传咨询提供了依据，同时深化了对本病临床和实验室特征的科学认识，对其诊断和管理具有一定参考价值。
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